Inaugurato nel 1998, l'itinerario museale comprende gli interrati, le sale gotiche al piano terra, le ex cucine, la Torre dei Leoni, l'Appartamento dello Specchio e consente di visitare quindici ambienti del Castello, seguendo un percorso che dai sotterranei della Torre dei Leoni, con le prigioni, si collega al piano terra per arrivare al piano nobile. Si ripercorrono in questo modo gli ambienti un tempo abitati dai Duchi, in cui è possibile ancora ammirare l'apparato decorativo, caratterizzato da marmi e affreschi. Tra il 2001 e il 2003 gli ambienti di interesse storico, artistico ed architettonico più rilevante sono stati collegati con una ricostruzione filologica di forte impatto didattico, progettata dall'architetto Gae Aulenti. La visita ruota intorno a quattro temi, diversi tra di loro ma in relazione con il Castello: la fabbrica come immagine del potere, la dinastia, la storia urbanistica di Ferrara e infine i domini estensi. Dal 2006, il Castello è anche sede di rappresentanza del progetto Ermitage Italia, frutto di di un accordo tra il Museo dell'Ermitage di San Pietroburgo e la Provincia di Ferrara, finalizzato alla catalogazione delle opere italiane del museo russo, con un’attenzione particolare al patrimonio estense.Il percorso di visita si snoda attraverso le Sale Gotiche, le Cucine Ducali, la Sala del Cordolo adiacente alla torre originaria di cui incorpora parte della struttura, la Prigione di Don Giulio. Al piano nobile si trova la Sala dell'Aurora, posta all'interno della torre dei Leoni, che fa parte, assieme alla Saletta dei Giochi e alla Sala dei Giochi, degli appartamenti privati e di rappresentanza realizzati dai Duchi a partire dalla seconda metà del XV secolo. Le decorazioni delle sale vennero affidate alla famiglia Filippi (il padre Camillo e i figli Cesare e Sebastiano), coadiuvata da Leonardo da Brescia e Ludovico Settevecchi: sono tutte databili al terzultimo decennio del XVI secolo. Da ricordare, inoltre, i “Camerini d'Alabastro” destinati alle collezioni ducali che comprendevano dipinti di Tiziano, Dosso Dossi e del Garofalo accorpati secondo un programma iconografico incentrato sul tema del baccanale e alternati alle sculture di Antonio Lombardo.