Collocato in piazza Gabriotti, a fianco della cattedrale dedicata ai Santi Florido e Amanzio, con la sua superficie di quasi 800 mq è uno dei più grandi musei italiani dedicati all’arte sacra. Originariamente costituito da due soli ambienti, ai quali si accedeva attraverso la sacrestia della cattedrale, è stato ampliato e istituzionalizzato nel 1991 con l’apertura di altri cinque locali, collocati su due piani e ricavati in parte dalle vecchie sacrestie sei-settecentesche, in parte da altri locali tre-quattrocenteschi già di pertinenza della chiesa. È del 2000 l’ultimo ampliamento, che ha esteso a dodici stanze lo spazio espositivo, includendo anche un grande salone gotico ad archi ogivali trasversali, forse in origine edificio religioso, sottoposto, al pari degli altri ambienti, ad una laboriosa opera di recupero. La raccolta si è formata con lo scopo di dare un’adeguata collocazione alle opere d’arte di proprietà del Capitolo della cattedrale e delle chiese del territorio e si contraddistingue per quantità e qualità di oggetti liturgici, che spaziano dal VI al XIX secolo. Oltre al Tesoro di Canoscio, testimonianza dei culti praticati dalle locali comunità cristiane del VI secolo, conserva lavori di oreficeria, tra cui un paliotto d’altare del XII secolo e un riccio di pastorale di oreficeria senese, calici, patene, ostensori e una ricca collezione di paramenti sacri che si segnala per l’integrità della maggior parte dei corredi. Il museo conserva anche importanti testimonianze documentarie relative alla storia ecclesiastica cittadina, tra le quali, in particolare, la pergamena con cui Federico Barbarossa pose sotto la sua protezione il clero, nonché dipinti di illustri artisti come Pintoricchio, Rosso Fiorentino, Francesco da Tiferno e Bernardino Gagliardi.