Il museo si trova in piazza San Rufino, nel settore nord-orientale di Assisi; dal II secolo a. C., zona della terrazza superiore la cui fronte meridionale, costituita da un muro in opera quadrata di travertino, è visibile all’interno della cattedrale e della cripta di San Rufino. Lungo il muro, nei pressi della torre campanaria, è collocata una cisterna quadrangolare. Il museo si articola all’interno della cripta di San Rufino per poi proseguire nel chiostro medievale e nei sotterranei dell’attiguo palazzo dei Canonici. Nell’area della cattedrale sono state individuate tracce di un centro di produzione ceramica, risalente al I secolo a. C. Il museo è stato riallestito nel 2006. La raccolta, istituita nel 1941 per volontà del vescovo Giuseppe Placido Nicolini, comprende opere appartenenti alla cattedrale o provenienti dagli oratori delle confraternite di Assisi e dalle parrocchie soppresse, suddivise in cinque sezioni: affreschi staccati, dipinti su tavola e su tela, paramenti sacri e oggetti di uso liturgico, oreficerie, materiali lapidei di età romana e medievale. Tra le opere sono da segnalare gli affreschi del Maestro di Santa Chiara, di Pace di Bartolo e di Puccio Capanna. Provenienti dall’oratorio di San Rufinuccio, questi ultimi rappresentano episodi della Passione di Gesù. Databili al 1334, sono ispirati ai cicli pittorici della Basilica di San Francesco, specialmente agli affreschi di Pietro Lorenzetti da cui Puccio Capanna deriva l’impianto compositivo della Flagellazione. Molto interessanti anche gli stendardi processionali tra i quali quello proveniente dalla Confraternita di Santa Caterina d’Alessandria con il Martirio di Santa Caterina d’Alessandria e i Santi Giacomo e Antonio Abate, concordemente attribuito al pisano Orazio Riminaldi, datato intorno al 1625. Sono inoltre conservati nel museo un polittico di Niccolò di Liberatore detto l’Alunno e dipinti di Matteo da Gualdo, di Dono Doni e di Cesare Sermei. Occupa uno spazio importante la collezione donata per lascito testamentario dal critico d’arte statunitense Frederick Mason Perkins, morto nel 1955 e molto legato alla città di Assisi, comprendente soprattutto opere tre-quattrocentesche di scuola toscana. Tra gli artisti presenti si annoverano Jacopo della Quercia, Filippo Lippi, Francesco di Giorgio Martini e Duccio di Buoninsegna.